第十二课生物

生物技术

学习目标

生物技术:利用活的有机体或来自有机体的酶来生产有用的产品和过程的技术属于生物技术。

欧洲生物技术联合会(EFB)对生物技术给出了以下定义:

将自然科学与生物、细胞及其组成部分以及用于产品和服务的分子类似物相结合称为生物技术。

生物技术原理

促成现代生物技术诞生的两项核心技术是:

  1. 基因工程:它涉及改变遗传物质化学成分的技术，将改变后的遗传物质引入宿主生物的技术;为了改变宿主生物的表型。
  2. 在生产过程中保持无菌(无微生物污染)环境，以便只大量生产所需的微生物/真核细胞。

转基因生物的三个基本步骤如下:

  1. 具有理想基因的DNA鉴定;
  2. 将鉴定出的DNA导入宿主;
  3. 在宿主中维持引入的DNA并将DNA转移给后代。

重组DNA技术工具

以下是重组DNA技术的主要工具:
限制性内切酶，聚合酶，连接酶，载体和宿主生物

限制性内切酶

切割DNA的酶叫做限制性内切酶。Hind II是第一个被发现的限制性内切酶。Hind II总是通过识别6个碱基对的特定序列在特定的点上切割DNA分子。这个特定的碱基序列被称为Hind II的识别序列。今天，已知的限制性内切酶超过900种。不同的酶识别不同的序列。

核酸外切酶:这些酶从DNA的末端去除核苷酸。

核酸内切酶:这些酶在DNA的特定位置进行切割。

限制性内切酶的命名:每种酶都是以分离出它的细菌命名的。命名系统基于细菌属、种和菌株。下表显示了EcoRI限制性内切酶的名称和隐含的命名系统。

EcoRI名称的派生
缩写 意义 描述
E 埃希氏杆菌属 属
有限公司 杆菌 物种
R RY 13 应变
我 首次发现 识别顺序

回文:正读和倒读时组成同一个单词的一组字母被称为回文。限制性内切酶切断DNA中的回文序列。以下是回文序列的示例:

5'—gaattc—3'
3'—cttaag—5'

限制性内切酶将DNA链从回文位点的中心切割了一点，但在相反链上相同的两个碱基之间。这就在末端留下了单链部分。每条链上都有一些悬垂的延伸，称为粘端。它们之所以如此命名，是因为它们与互补的切割物形成氢键。末端的粘性促进了DNA连接酶的作用。

当被相同的限制性内切酶切割时，所产生的DNA片段具有相同的“粘性末端”，并且可以使用DNA连接酶将它们连接在一起(端到端)。

除非用相同的限制性内切酶切断载体和源DNA，否则无法产生重组载体分子。

DNA片段的分离与分离:限制性内切酶对DNA的切割形成DNA片段。这些碎片可以通过一种称为凝胶电泳的技术分离。由于DNA片段是带负电荷的分子，它们可以通过在电场作用下通过介质/基质向阳极移动来分离。

琼脂糖是最常用的基质。它是从海草中提取的天然聚合物。

DNA片段通过琼脂糖凝胶提供的筛分作用按其大小分离。所以，较小的碎片比较长的碎片移动得更远。

分离的DNA片段用溴化乙锭染色。在那之后，暴露在紫外线辐射下使它们可见。在这种情况下，DNA片段呈现为亮橙色的条带。

从琼脂糖凝胶中提取分离的DNA条带;通过将它们与克隆载体结合来构建重组DNA。

克隆载体

一小段DNA;从病毒、质粒或高等生物的细胞中提取，能够稳定地保存在生物体内，并可插入外源DNA片段用于克隆;称为克隆向量。

以下是便于克隆到载体所必需的特性。

  1. 复制起始(ori): DNA中复制起始的序列称为复制起始(ori)。当一段DNA与这个序列相连时，它就可以在宿主细胞内复制。如果你想恢复目标DNA的许多拷贝，它应该克隆在一个“ori”支持高拷贝数的向量中。
  2. 可选择标记:这些物质有助于识别和消除非转化基因，并选择性地允许转化基因的生长。一般来说，编码对抗生素(氨苄西林、氯霉素、四环素、卡那霉素等)耐药的基因被认为是有用的选择性标记大肠杆菌．正常的大肠杆菌细胞对这些抗生素都没有耐药性。
  3. 克隆位点:所有克隆载体都具有常用限制性内切酶的识别位点。但是要连接外星DNA，载体需要很少的，最好是单一的识别位点。外源DNA的结扎是在两个抗生素抗性基因之一的限制位点上进行的。

例子:在pBR322的四环素耐药基因的Bam H I位点可以连接到一个外源DNA。重组质粒由于外源DNA的插入而失去对四环素的抗性，但仍可通过将转化体镀在含氨苄青霉素的培养基上从非重组质粒中筛选出来。

之后，转化子(生长在含氨苄西林的培养基上)转移到含四环素的培养基上。

重组菌在含氨苄西林的培养基中生长，在含四环素的培养基中不能生长。

但非重组菌会在含有这两种抗生素的培养基中生长。在这种情况下，一个抗生素抗性基因有助于选择转化基因，而其他抗生素抗性基因由于插入外来DNA而失去活性。因此，它有助于重组的选择。

注意:由于抗生素失活而选择重组体需要同时镀在两个含有不同抗生素的板上。因此，这是一个繁琐的过程。

已经开发了可选择的替代标记，可以根据它们在显色底物存在时产生颜色的能力将重组子与非重组子区分开来。

在这种情况下，重组DNA被插入到一种酶的编码序列中，α-半乳糖苷酶。这导致了酶的失活。(这称为插入失活)。

如果细菌质粒中没有插入物，显色底物的存在会使菌落呈蓝色。

插入的存在导致α-半乳糖苷酶的插入失活，菌落不产生颜色。这样的菌落被确定为重组菌落。

动植物基因克隆载体:细菌和病毒一直在转移它们的基因来转化真核细胞;为了迫使它们去做细菌或病毒想要的事情。现在，这些病原体的工具可以转化为有用的载体，将有益的基因传递给人类。例如;肿瘤诱导(Ti)质粒农杆菌属tumifaciens现在已被改造成对植物不再致病的克隆载体。这种载体现在可以用来将有益基因转移到许多植物中。

胜任寄主(重组DNA转化用)

我们知道DNA是亲水分子。因此，它不能穿过细胞膜。为了迫使细菌吸收质粒，细菌细胞需要“有能力”吸收DNA。这是通过用特定浓度的二价阳离子(如钙)处理细菌细胞来实现的。它提高了DNA通过细胞壁上的小孔进入细菌的效率。

重组DNA可以通过以下步骤进入这些细胞:


微喷射:在这种方法中，重组DNA直接注射到动物细胞的细胞核中。

基因枪:该方法适用于植物细胞。在这种方法中，细胞被涂有DNA的高速金或钨微粒轰击。

解除武装病原体:当解除武装的病原体感染细胞时，它将重组DNA转移到宿主体内。

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